Röntgen azon kiváló tudósok közé tartozott, akiknek az iskolai előmentele alapján nem lehetett volna nagy tudományos jövőt jósolni. Szülei először egy magániskolába, majd egy utrechi ipariskolába iratták be. Egy ártalmatlan diákcsíny miatt azonban még magánúton sem tehetett érettségi vizsgát. Ennek további élete során többször is hátrányát látta. Az utrechti egyetemen például természettudományi előadást csak mint érdeklődő hallgathatott.

Végül a zürichi Technische Hochschulera iratkozott be 1865-ben, mert ott nem kérték az érettségi bizonyítványt. Itt figyelt fel képességeire A. Kundt, akinek 1869-től  asszisztense lett. A főiskola elvégzése után Röntgen a gázelmélettel foglalkozó értekezésével doktori címet (PhD) szerzett.

1870-ben Kundt magával vitte Röntgent a würzburgi egyetemre. Hiába volt már doktorátusa, a hiányzó érettségi vizsga ismét megakadályozta az előrelépésben: nem tudta megszerezni a magántanári képesítést. Követte Kundtot a strassbourgi egyetemre, s ott végül megkapta az oktatási engedélyt.

Röntgen nagyon szeretett kísérletezni. 1873-1874 között a hohenheimi Mezőgazdasági Főiskola matematika-fizika professzora volt.  Mivel azonban a főiskola laboratóriumának kísérleti felszerelései elmaradottak voltak, Röntgen hamarosan visszatért Strassbourgba.

1879-től a giesseni egyetem kísérleti fizikai tanszékére került. Kísérleteit az elektromágnesség és a fénytan területén végezte. 1888-ban kimutatta, hogy az elektromosan polarizált dielektrikum mozgásának az elektromos áramhoz hasonló hatása van. Ezt a hatást felfedezve igazolódott J.C.Maxwell elmélete. H.A.Lorentz nyomán ezt az áramot Röntgen áramnak nevezték el. 1889-ben elvállalta a würzburgi egyetem Fizikai Intézetének a vezetését, 1894-től pedig rektorrá is választották. 1900-ban Münchenben az egyetem Fizikai Intézetének igazgatójává nevezték ki.

1901-ben őt érte az a megtiszteltetés, hogy a világ első tudósaként munkáját Nobel díjjal jutalmazták.

1904-től visszavonult a közélettől és Münchentől 60 km-re Weilheimbe költözött. 1920-ban saját kérésére felmentették a professzori igazgatói megbízás alól. Ebben az évben hozta nyilvánosságra a kristályok fizikájával kapcsolatos munkáját.

A háború utáni években hiányosan táplált szervezete nem tudott ellenállni az emésztőrendszerét megtámadó betegségnek, s 1923-ban Münchenben meghalt.

A katódsugárzás

Röntgen legnagyobb jelentőségű kutatásai a katódsugárzás vizsgálatának területére esnek. A katódsugárzást Julius Plücker fizikus 1859-ben fedezte fel. A katódsugárzás a csaknem légüresre szivattyúzott, ún. Geissler-csőben jön létre, ha a csőben elhelyezett két elektródra feszültséget kapcsolunk. A negatív potenciálra kapcsolt elektródot katódnak, a pozitív potenciálra kapcsoltat pedig anódnak szokás nevezni.  A csőben - a benne maradt gáz nyomásától függően -  érdekes jelenségek játszódnak le. Ha a csőben maradt gáz nyomása alacsony, a csőben kisülés indul el, és ennek hatására a csőben lévő gáz világítani kezd (a mai fénycsövekben is hasonló jelenség okozza a fénykibocsátást). A gáz nyomását tovább csökkentve a fény lassan elhalványul (hiszen nincs már a csőben gáz, ami fényt bocsátana ki), de a csőnek a katóddal szemben lévő üvegfala zölden fluoreszkálni kezd. Ezt a fluoreszkálást a csőben egyébként nem látható "katódsugaraknak" tulajdonították. Ma már tudjuk, hogy a katódsugarak tulajdonképpen a katód anyagából kilépett, és az elektródokra kapcsolt feszültség hatására felgyorsult, nagysebességű elektronokból állnak. Ezek az elektronok a katóddal szemben lévő üvegfalba ütközve késztetik fénykibocsátásra az ott lévő atomokat. Ha a katóddal szemben helyezzük el a másik elektródot (az anódot), akkor az elektronok abba csapódnak be.

A röntgensugárzás felfedezése

1895. november 8-áról 9-ére virradó éjszaka Röntgen Lénárd Fülöp és H.Hertz kísérleteit megismételve - szinte véletlenül - felfedezte a röntgensugárzást.

Teljesen átlátszatlan fekete papírba burkolta be a kisülési csövet, hogy a katódsugarak által a csőben keltett gyenge fluoreszkáló fény se juthasson ki a csőből. Feltűnt viszont, hogy a közelben elhelyezett fluoreszkáló só élénken világít, annak ellenére, hogy semmiféle látható fény közvetlenül nem érte. A világítást annyiszor tapasztalta, ahányszor bekapcsolta a kisülési csövet. Ebből - nagyon helyesen - arra következtetett, hogy a csőből olyan, szemmel nem látható sugárzás indul ki, amely át tud hatolni még a fekete papírburkolaton is. Hamarosan arra is rájött, hogy ezek a különleges sugarak (ezeket Röntgen először X-sugaraknak nevezte el) nemcsak egy vékony fekete papíron hatolnak át, hanem sokkal vastagabb, szilárd anyagon - pl.  egy emberi testrészen - is.

Felfedezése véletlenszerűnek is tekinthető, mivel a fluoreszkáló sót egy másik kísérlet miatt készítette oda. Eredményeit 1896. jan. 20-án a párizsi Akadémián H. Poincaré jelentette be, felmutatva a Röntgen által készített fényképeket.

1914-ben a freiburgi egyetem fizikai intézetében készült röntgenfelvétel egy kézfejről. Hasonló képeket Röntgen is készített

Egy fiatal beteg mellkasának  röntgensugaras átvilágítása 1896 körül. A röntgensugarakat a gyógyászatban először a tüdőbaj megállapítására alkalmazták.